پاسخ: اول از همه، تازگی نمونه (freshness) حرف اول را میزند! چون اگر دنبال انگلهای متحرک (مثل ژیاردیا یا لاروها) هستیم، با کهنه شدن نمونه حرکتشان را از دست میدهند. همچنین حجم نمونه باید حداقل ۱ گرم (تقریباً به اندازه یک حبه قند) باشد تا انگلهای کمتعداد را از دست ندهیم.
نکته فنی مهم دیگر، تنظیم کندانسور (sub-stage condenser) میکروسکوپ است. برخلاف اسمیر خون که کنتراست کم میخواهد، برای دیدن تخم انگلها باید کنتراست را بالا ببرید (کندانسور را پایین بیاورید یا دیافراگم را ببندید). کل منطقه زیر لامل را با لنز ۱۰x بررسی کنید و برای تأیید از لنز ۴۰x استفاده کنید.
متن استناد انگلیسی: “It is important to be reminded that feces should be fresh (to preserve parasite motility, if present) and an appropriate sample volume (≥1 g formed feces) should be used for optimal parasite recovery. … adjust the sub-stage condenser to provide better contrast for visualization of parasites. Furthermore, the entire area under the coverslip should be examined using the 10× objective (with use of the 40× objective for verification as needed).”
پاسخ: قبل از اینکه به میکروسکوپ نگاه کنی، اول با چشم غیرمسلح (ماکروسکوپی) مدفوع را بررسی کن. به رنگ (color) و قوام (consistency) و وجود خون، موکوس یا حباب (froth/air bubbles) دقت کن که نشانه بیماری رودهای است. همچنین به دنبال بندهای کرم نواری (tapeworm proglottids) باش که شبیه دانه برنج یا خیار کوچک در سطح مدفوع یا اطراف مقعد حیوان دیده میشوند.
پاسخ: این روش که به آن “wet mount” (لام مرطوب) هم میگویند، مخصوص پیدا کردن انگلهای متحرک (motile) است. چون محلولهای شناورسازی معمولاً این انگلهای ظریف را تخریب یا بیهوش میکنند، پس حتماً باید از اسمیر استفاده کنیم.
انگلهای هدف: Giardia (تریپوزوئیتهای متحرک)، Tritrichomonas، Pentatrichomonas، آمیبها و لاروهای نماتودها. نکته طلایی: برای دیدن حرکت، حتماً نمونه باید فوقالعاده تازه باشد. (برای مشاهده طرز انجام، به ویدیو ۸۰.۱ و شکل ۸۰.۱ مراجعه کن).
پاسخ: شناورسازی (که در اشکال ۸۰.۲ و ۸۰.۳ نشان داده شده) بر اساس وزن مخصوص (Specific Gravity) کار میکند؛ یعنی تخم انگلها چگالی کمتری از محلول دارند و به سطح میآیند، درحالی که بقیه مواد مدفوع ته نشین میشوند. برای جداسازی بهتر، حتماً از سانتریفیوژ (centrifugation) استفاده کن (نسبت به روش ایستاده خیلی بهتر است).
انتخاب محلول شناورساز بسیار مهم است، هرچند برای اکثر انگلها فرقی ندارد، اما برای بعضیها حیاتی است:
همیشه وزن مخصوص محلول را با هیدرومتر (hydrometer) چک کن! همچنین اگر به مقاومت دارویی (مثل مقاومت به بنزیمیدازول در قلابدارها) شک داری، باید تعداد تخم در گرم (EPG - Eggs Per Gram) را با تکنیک کمی (وزن کردن دقیق مدفوع) حساب کنی تا پاسخ به درمان را بسنجی.
متن استناد انگلیسی: “recovery of certain parasites may be either enhanced (e.g., ZnSO4 and Giardia cysts; Sheather’s sucrose and Trichuris, Taenia, and Physaloptera ova) or hindered (NaNO3 and Giardia cysts) by use of certain solutions. Furthermore, specific gravity of flotation solutions should be checked routinely with a hydrometer.”
پاسخ: - برمن (Baermann): این روش فقط برای جداسازی لاروهای متحرک (motile larvae) از مدفوع تازه طراحی شده است. مخصوص انگلهایی مثل Aelurostrongylus (کرم ریوی گربه) و Strongyloides. اگر تخم یا لارو مرده باشد، از این روش خارج نمیشوند. - رسوبگذاری (Sedimentation - شکل ۸۰.۴): وقتی تخم یا لارو آنقدر سنگین (dense) است که در محلول شناورسازی بالا نمیآید (مثلاً تخم برخی ترماتودها)، از رسوبگذاری استفاده میکنیم. در این روش به جای محلول شناورساز، از آب یا نرمال سالین استفاده میکنیم و با سانتریفیوژ، انگلها را کف لوله جمع میکنیم (چون سریعتر از روش ایستاده است).
پاسخ: کشت مدفوع در دامپزشکی معمول نیست، مگر برای تشخیص قطعی تریتریکوموناس بلابرنی (Tritrichomonas blagburni) در گربهها. کشت را میتوان با محیط اختصاصی In Pouch TF-Feline یا محیط Diamond’s media انجام داد و سپس نمونه را به آزمایشگاه ارجاع داد.
پاسخ: روشهای ایمونولوژیک، مخصوصاً برای ژیاردیا خیلی کمککننده هستند (چون کیست ژیاردیا گاهی در شناورسازی دیده نمیشود). استفاده همزمان از کیت آنتیژن ژیاردیا به همراه شناورسازی سولفات روی، حساسیت تشخیص را بالا میبرد.
اما بزرگترین مزیت، تشخیص آنتین (pre-patent infections) است؛ یعنی ۱ تا ۶ هفته زودتر از اینکه تخم در مدفوع ریخته شود، میتوانیم آنتیژن انگل را در مدفوع پیدا کنیم. همچنین تشخیص آنتیژن (مثل کیتهای آزمایشگاه IDEXX) برای انگلهای Toxocara، Ancylostoma، Trichuris و Dipylidium موجود است و به ما کمک میکند تشخیص دهیم که آیا آلودگی واقعی است یا صرفاً تصادفی (spurious) ناشی از خوردن مدفوع حیوان دیگر است.
متن استناد انگلیسی: “Benefits of antigen-based diagnostics include the ability to detect pre-patent infections 1-6 weeks before egg-shedding and environmental contamination can occur, as well as aiding in the determination of spurious versus real parasitism.”
پاسخ: PCR (واکنش زنجیرهای پلیمراز) با تکثیر تکه خاصی از DNA انگل، آن را با دقت فوقالعادهای شناسایی میکند. دو نوع دارد: - Universal (همگانی): گروه انگل را مشخص میکند (مثلاً میگوید ژیاردیا هست). - Species-specific (اختصاصی گونه): دقیقاً گونه را مشخص میکند (مثلاً Giardia intestinalis Assemblage A را از B جدا میکند، یا Cryptosporidium parvum را از C. hominis تشخیص میدهد). همچنین میتواند تخمهای Taenia را از Echinococcus (که از نظر ظاهری یکساناند) تفکیک کند و یا Toxoplasma را از Hammondia در گربه تشخیص دهد.
محدودیتهای مهم (که در آزمون حتماً میپرسند): ۱. نیاز به محیط کاملاً تمیز و تجهیزات خاص دارد. ۲. اگر نمونه فرمالین (فرمالدهید) فیکس شده باشد، استخراج DNA سخت میشود و ممکن است جواب خراب شود. بهترین فیکساتور اتانول ۷۰٪ است. ۳. منفی کاذب (False Negative): جواب منفی یعنی انگل در آن نمونه خاص نبوده است، نه اینکه حتماً حیوان انگل ندارد. برای افزایش حساسیت، چند نمونه در زمانهای مختلف بفرست.
پنل اختصاصی (qPCR): شرکت Antech پنلی به اسم KeyScreen GI Parasite PCR دارد که شامل ۲۲ تست qPCR است و حتی میتواند سویههای مقاوم به بنزیمیدازول در قلابدارها را تشخیص دهد.
متن استناد انگلیسی: “PCR is a useful resource when other fecal examination methods fail or when additional diagnostic information is needed. … it is important to be aware that a negative result does not necessarily mean that the target parasite is not present in the host nor the cause of disease. It could simply mean that parasites were not present in the sample that was analyzed.”
پاسخ: سیستم VETSAN IMAGYST (تولید شده توسط Zoetis - شکل ۸۰.۵) اولین پلتفرم تجاری است که از ترکیب تشخیص تصویر (image recognition) و الگوریتمهای یادگیری عمیق (Deep Learning) مبتنی بر ابر استفاده میکند.
روش کار: ۱ گرم مدفوع را با سولفات روی (وزن مخصوص ۱.۱۸) یا شکر (وزن مخصوص ۱.۲۸) مخلوط، سانتریفیوژ میکنیم و زیر یک میکروسکوپ تخصصی اسکن میشود. هوش مصنوعی تخمها را پیدا کرده و با کادر (box) مشخص میکند (شکل ۸۰.۵-A) و گزارش وب-بیس قابل چاپ به ما میدهد (شکل ۸۰.۵-B).
مزیت بزرگ: برخلاف سیستمهای قدیمی (یادگیری سطحی)، یادگیری عمیق مدام با دادههای جدید آموزش میبیند و هرچه بیشتر استفاده شود، دقتش بالاتر میرود. این سیستم برای کلینیکهای شلوغ عالی است؛ چون نظر شخصی (سلیقهای) را حذف کرده، یکنواخت کار میکند و عکسها در فضای ابری ذخیره میشوند تا برای آموزش صاحب حیوان یا مشاوره با متخصصین استفاده شوند.
متن استناد انگلیسی: “Artificial intelligence image recognition can provide a reliable and consistent approach to fecal examination for busy veterinary practices, while allowing veterinary professionals to review and confirm the identified parasite images.”
نکته نهایی برای آزمون تخصصی: حتماً به خاطر داشته باش که هیچکدام از این روشها بهتنهایی صددرصد نیستند. استراتژی طلایی، ترکیب روشها (مثلاً شناورسازی + آنتیژن + PCR در موارد مشکوک) است تا بهترین حساسیت تشخیصی را بهدست آوری.