حالا بریم سراغ پاسخها، به ترتیب هر سؤال.
پاسخ:
کشت سلول یعنی پرورش سلولهای یوکاریوتی (یعنی سلولهای دارای هستهٔ واقعی، مثل سلولهای پستانداران) در شرایط کنترلشدهٔ آزمایشگاهی (in vitro). خیلی از عوامل بیماریزا، مخصوصاً ویروسها، برای تکثیر به سلول زنده نیاز دارند. قبل از کشت سلول، تشخیص ویروسها بیشتر با حیوان زنده یا تخممرغ جنیندار انجام میشد.
متن اصلی برای استناد (بخشی از Introduction):
“Infectious agents that require living host cells for replication may be isolated in the natural host (in vivo), in embryonated eggs (in ovo), or in cell culture.”
اما چرا امروز با وجود PCR و آزمایشات مولکولی، بازم از کشت سلول استفاده میکنیم؟
دلیلش اینه که PCR سرعت و حساسیت بالایی داره، ولی کشت سلول هنوز برای سه کار حیاتی لازمه:
پس با اینکه هزینه و زمان کشت سلول (چند روز تا هفته) بیشتر از PCR است، اما در بعضی موارد هنوز بهترین یا تنها راه است.
پاسخ:
موقعی که به یک عامل عفونی جدید یا غیرمعمول شک داریم، یا وقتی که روشهای مولکولی جواب قطعی نمیدهند، یا نیاز به ویروس زنده برای آزمایشات تکمیلی داریم. همچنین برای بیماریهایی که پاتوژنهای متعدد دارند، کشت سلول میتونه همهٔ ویروسهای قابل تکثیر رو جدا کنه، در حالی که پنل PCR فقط اونایی رو که پرایمر دارند تشخیص میده.
علاوه بر این، در ارزیابی داروهای جدید ضدویروس و همچنین سنجش عیار آنتیبادی (مثل آزمایش پلاک کاهشی) کشت سلول نقشی کلیدی داره.
متن اصلی (KEY POINTS):
“Cell culture remains an important technique for: (1) nontargeted pathogen discovery, (2) amplification of viruses detected by molecular methods for genomic sequencing, (3) vaccine manufacture, and (4) virus neutralization assays.”
پاسخ:
موفقیت کشت سلول به شدت به کیفیت نمونه بستگی داره. سه اصل طلایی:
زمان نمونهگیری: هرچه زودتر از شروع علائم بالینی، بهتر. چون دفع ویروس معمولاً قبل از شروع علائم شروع میشه و ممکن است فقط چند روز طول بکشه. مثلاً در عفونت روتاویروس، بعد از ۴۸ ساعت از شروع اسهال، دیگه ویروس در مدفوع قابل تشخیص نیست.
نوع نمونه: با توجه به پاتوژنز عامل مظنون انتخاب میشه. مثلاً برای ویروس آنفلوانزای سگ، نمونهٔ خون بیفایده است، چون تکثیر ویروس محدود به دستگاه تنفس است. نمونههای ترجیحی در جدول ۱.۲ کتاب خلاصه شده (که من در ادامه خلاصهاش را میآورم). بهتر است از چند محل نمونه بگیرید (مثلاً هم سواب حلق و هم سواب بینی).
حمل و نقل: نمونهها باید در محیط انتقال ویروس (VTM – Virus Transport Medium) که حاوی آنتیبیوتیک و پایدارکنندهٔ پروتئین (مثل سرم جنین گاوی) است، قرار بگیرند. مایعات مثل خون، مایع مغزی-نخاعی (CSF) و لاواژ برونکوآلوئولار نیازی به VTM ندارند، ولی خون باید در لولهٔ EDTA باشد. نمونهها رو باید بلافاصله سرد (یخچال، نه فریزر) کنید و حداکثر ظرف ۲۴ ساعت به آزمایشگاه برسانید. اگر تأخیر بیشتر از ۲-۳ روز شد، میتوان در ۷۰- درجهٔ سانتیگراد فریز کرد (نه ۲۰- درجه) و با یخ خشک ارسال کرد.
متن اصلی برای استناد:
“Specimens should be collected as early as possible following the onset of clinical signs because viral shedding commences before the onset of signs and may continue for only a few days.”
“Swab specimens should be collected by placing a long-shafted swab in the area to be sampled, rotating the swab against the mucosa, and allowing the secretions to be absorbed for approximately 5 to 10 seconds.”
نکته دربارهٔ سواب: حتماً از سواب با دستهٔ پلاستیکی و الیاف مصنوعی استفاده کنید، چون سواب پنبهای-چوبی ممکن است بازدارنده (inhibitor) داشته باشد.
خلاصهٔ جدول ۱.۲ (نمونههای پیشنهادی):
| دستگاه درگیر | نمونهٔ مناسب |
|---|---|
| تنفس (سگ) | سواب حلقی/بینی، تراشهشویی، لاواژ برونکوآلوئولار (۵-۱۰ میلیلیتر)، بافت ریه |
| تنفس (گربه) | سواب حلقی/بینی، بافت ریه |
| چشم | سواب یا خراش ملتحمه |
| اعصاب مرکزی | مایع CSF (حداقل ۰٫۵-۱ میلیلیتر)، خون (۵ میلیلیتر)، بافت مغز در کالبدگشایی |
| گوارش | مدفوع (به اندازهٔ زیتون) یا حداقل ۵ میلیلیتر مدفوع مایع، بیوپسی روده |
| تناسلی | سواب واژینال، خراش وزیکول |
| خون | ۸-۱۰ میلیلیتر خون کامل در EDTA (برای ارلیشیا، آناپلاسما، ریکتزیا، FeLV، FIV) |
پاسخ:
سلولها معمولاً به صورت یک لایهٔ تکی (monolayer) بر روی کف فلاسکهای پلاستیکی مخصوص رشد میکنند. محیط کشت (مثل MEM یا DMEM) حاوی نمکهای متعادل، اسیدهای آمینه، گلوکز، ویتامینها و بافر بیکربنات است و معمولاً با سرم جنین گاوی (FBS) و آنتیبیوتیکها مکمل میشود تا از آلودگی باکتریایی جلوگیری شود. فلاسکها در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه و ۵٪ CO₂ نگهداری میشوند.
دو نوع اصلی سلول:
کشت سلول اولیه (primary cell culture): مستقیماً از بافت حیوان گرفته میشوند، مثلاً کلیهٔ میمون. این سلولها معمولاً مخلوطی از انواع سلولها هستند و برخی عملکردهای اختصاصی خود را حفظ میکنند، بنابراین برای جداسازی ویروسهایی که به سلول خاصی نیاز دارند، عالیاند. ولی عمر کوتاهی دارند (چند بار پاساژ) و بهدست آوردنشان گران است.
ردیف سلولی پیوسته (continuous cell line): این سلولها یا از سلولهای سرطانی منشأ گرفتهاند (مثل HeLa) یا در اثر جهش خودبهخود یا مهندسی ژنتیک «جاودانه» شدهاند. این نوع سلولها راحتتر در دسترس هستند، ویژگیهای قابل پیشبینی دارند و رایجترین نوع در آزمایشگاههای تشخیصی هستند. مثلاً سلولهای MDCK (از کلیهٔ سگ) و CRFK (از کلیهٔ گربه) و Vero (از کلیهٔ میمون سبز آفریقایی).
متن اصلی برای استناد:
“Primary cell cultures have two distinct advantages… they are generally of a mixed cell population so that a virus that only grows in an endothelial cell, for example, could still be isolated… Also, primary cultures may maintain differentiated characteristics that are essential for virus propagation.”
نکتهٔ جالب: بعضی ردیفهای سلولی بهصورت ژنتیکی تغییر داده شدهاند تا گیرندهٔ ویروس را بیان کنند. مثلاً Vero-SLAM که پروتئین SLAM (گیرندهٔ لنفوسیتی ویروس دیستمپر سگ) را دارد، جداسازی ویروس دیستمپر را خیلی آسان میکند (تصویر ۱.۱ رو ببینید که شکل فلاسک و تک لایهٔ سلولی رو نشون میده).
آلودگیهای مهم:
- مایکوپلاسما (Mycoplasma) میتواند از فیلترها عبور کند و باعث تغییر شکل سلول و اختلال در تکثیر ویروس شود. برای تشخیص از رنگ Hoechst یا PCR اختصاصی مایکوپلاسما استفاده میشود.
- آلودگی متقاطع ردیفهای سلولی مثلاً سلول HeLa که خیلی مقاوم است، ممکن است سایر ردیفها را آلوده کند. بانکهای سلولی معتبر مثل ATCC با روشهای ژنتیکی هویت سلولها را کنترل میکنند.
پاسخ:
ابتدا نمونه (مثلاً سواب یا بافت) را در محیط کشت سوسپانسیون میکنند و سپس سانتریفیوژ یا فیلتر میکنند تا باکتری و بقایا حذف شود. سوسپانسیون را روی تکلایهٔ سلولی میریزند و ۱ تا ۳ ساعت میگذارند تا ویروس جذب سلول شود، سپس مایع را برمیدارند و محیط تازه اضافه میکنند.
از اینجا به بعد، هر روز تکلایه را با میکروسکوپ معکوس (inverted microscope) بررسی میکنند تا ببینند آیا تغییرات غیرعادی در سلولها دیده میشود یا نه. این تغییرات را اثر سیتوپاتیک (Cytopathic Effect – CPE) مینامند. اگر CPE مشاهده شود، یعنی ویروس در حال تکثیر است.
پاسخ:
CPE یعنی تغییرات قابل مشاهده در ریختشناسی سلولها که بر اثر آلودگی ویروسی ایجاد میشود. انواع شایع CPE:
برای ویروسهایی که CPE ایجاد نمیکنند (non-cytopathic) چه کنیم؟
دو راه اصلی هست:
متن اصلی برای استناد:
“Some viruses are relatively noncytopathogenic. The presence of some of these viruses can be demonstrated by adding washed erythrocytes to the monolayer and examination of the monolayer for evidence of hemadsorption.”
پاسخ:
آزمایش پلاک (Plaque assay) یک روش کمی برای اندازهگیری تعداد ذرات عفونی ویروس در یک نمونه است. روش کار:
تصویر ۱.۵ رقتهای مختلف ویروس وزیکولوستوماتیت رو نشون میده که پلاکها به صورت لکههای روشن دیده میشوند.
کاربردهای بالینی و پژوهشی:
- سنجش تأثیر داروهای ضدویروس (کاهش تعداد پلاک).
- آزمون خنثیسازی پلاک (PRNT – Plaque Reduction Neutralization Test): برای اندازهگیری آنتیبادی خنثیکننده در سرم حیوان. مثلاً برای تشخیص آنتیبادی علیه ویروس نیل غربی یا ویروس زیکا که با سایر ویروسها واکنش متقاطع دارند، این روش بسیار اختصاصی است.
پاسخ:
دلایل فراوانی داره و یک نتیجهٔ منفی هرگز به معنای «قطعاً ویروسی نیست» نیست. مهمترین دلایل (که در باکس ۱.۲ کتاب آمده):
متن اصلی برای استناد (Box 1.2):
“Reasons for negative test results… lack of viral shedding… antibody interference… loss of organism viability… lack of cell sensitivity… overgrowth by bacterial or fungal agents…”
پاسخ:
نه، لزوماً به معنی عامل بیماری زا نیست. این نکتهٔ بسیار مهمی است. بسیاری از ویروسها میتوانند در دستگاه تنفس یا گوارش حیوانات سالم هم تکثیر شوند بدون اینکه بیماری ایجاد کنند. به خصوص در کشت سلول که یک جداسازی غیرهدفمند است، ممکن است ویروسی را پیدا کنید که فقط یک «مسافر» است. در صورتی که با پنل PCR، همین مسئله بیشتر به چشم میآید، ولی در کشت سلول هم صادق است.
برای اینکه نتیجهٔ مثبت را به بیماری ربط دهید، باید به هماهنگی با علائم بالینی، سیر بیماری، یافتههای کالبدگشایی و البته آزمایشهای سرولوژی (افزایش آنتیبادی اختصاصی در دو نوبت) نیز توجه کنید. در بسیاری از موارد، شدت بیماری وقتی بیشتر است که چند عامل همزمان حضور داشته باشند.
متن اصلی برای استناد:
“It is imperative that veterinary clinicians be aware that the detection of a virus in a specimen does not always imply that the organism is the cause of the animal’s clinical signs. This is especially true for specimens collected from the respiratory or gastrointestinal tracts…”
پاسخ:
کار با کشت سلول و ویروسها نیاز به رعایت اصول ایمنی زیستی دارد تا هم نمونه آلوده نشود و هم پرسنل آزمایشگاه در امان باشند. در آمریکا، مرکز کنترل بیماری (CDC) چهار سطح ایمنی زیستی (Biosafety Level – BSL) را تعریف کرده:
متن اصلی برای استناد (جدول ۱.۴):
“BSL 2… Most veterinary viruses, including influenza viruses… Access to the laboratory restricted when work is taking place…”
نکتهٔ کاربردی برای کلینیکها: اگر شک به یک عامل BSL-3 یا ۴ دارید، نمونه باید به آزمایشگاههای مجهز و معتبر ارسال شود و حتماً قوانین حمل مواد عفونی (Category A یا B) رعایت گردد. بیشتر نمونههای دامپزشکی در ردهٔ Category B قرار میگیرند، مگر اینکه عامل بتواند بیماری کشنده یا ناتوانکننده در انسان یا حیوان ایجاد کند.