پاسخ: ایمونواسی (Immunoassay) به هر آزمایشی گفته میشود که بر اساس اتصال اختصاصی آنتیژن به آنتیبادی (Antigen-Antibody binding) طراحی شده باشد. سرولوژی (Serology) در اصطلاح رایج، زیرمجموعهای از آن است که بیشتر به تشخیص آنتیبادی در سرم (serum) گفته میشود، اما ایمونواسی میتواند روی مایعات دیگر مثل پلاسما، مایع مغزینخاعی (CSF) یا ادرار هم انجام شود و هم آنتیژن و هم آنتیبادی را اندازهگیری کند.
نقل قول از متن اصلی: “Serology is the measurement of antigen-antibody interactions for diagnostic purposes, but is most often used to refer to the detection of antibodies in serum. Assays used to measure antigen-antibody interactions can also be used on body fluids other than serum…”
پاسخ:
نکته بسیار مهم از متن: “Positive immunoassay results do not always imply active infection, and negative results do not rule out infection (e.g., mucosal infection).”
پاسخ: وقتی حیوان برای اولین بار با یک عامل بیماریزا مواجه میشود، یک فاز تأخیر (Lag phase) به مدت ۵ تا ۷ روز وجود دارد تا آنتیبادی در خون قابل شناسایی شود (شکل ۲.۱ کتاب را ببینید).
قانون ۴ برابری (Fourfold increase): برای تشخیص عفونت حاد، باید دو نمونه خون با فاصله ۲ تا ۴ هفته (نمونه حاد و نقاهت) بگیریم. اگر تیتر آنتیبادی حداقل ۴ برابر افزایش یابد (مثلاً از ۱:۴ به ۱:۱۶)، آن را معنیدار میدانیم. حتماً هر دو نمونه را به یک آزمایشگاه واحد بفرستید تا خطای بینآزمایشگاهی کاهش یابد.
نقل قول از متن: “Seroconversion is consistent with recent infection, and at least a fourfold increase in titer is required for the change to be considered significant (e.g., 1:4 to 1:16; 1:128 to 1:512). Because serologic test results can differ between laboratories that perform the same assay, the same laboratory should be used to determine the acute and the convalescent titer.”
الف) ایمونوفلورسانس (IFA - Immunofluorescence Assay) - نوع مستقیم (Direct): آنتیبادی نشانهدار با فلورسین (Fluorescein) را مستقیماً روی لام حاوی نمونه (مثلاً خراش ملتحمه برای دیستمپر یا بافت مغز برای هاری - شکل ۲.۲) میریزیم و زیر میکروسکوپ فلورسنت نگاه میکنیم. - نوع غیرمستقیم (Indirect): برای اندازهگیری تیتر آنتیبادی در سرم استفاده میشود (مثلاً برای ارلیشیا یا آناپلاسما). در این روش، سرم حیوان را روی آنتیژنهای چسبیده به لام میریزیم و سپس با آنتیبادی ثانویهی نشانهدار، اتصال را شناسایی میکنیم.
ب) الایزا (ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) رایجترین روش در مطب (مثل تستهای SNAP). بر اساس آنزیم و تغییر رنگ کار میکند. - ساندویچ الایزا (Sandwich ELISA - شکل ۲.۵): برای تشخیص آنتیژن (مثل آنتیژن FeLV). یک آنتیبادی در کف پلیت چسبیده، آنتیژن نمونه را میگیرد و آنتیبادی دیگری که به آنزیم متصل است، به همان آنتیژن متصل شده و باعث ایجاد رنگ میشود. - الایزای رقابتی (Competitive ELISA): برای تشخیص آنتیبادی در نمونه. آنتیبادی نمونه با آنتیبادی نشانهدار برای اتصال به آنتیژن رقابت میکند؛ هرچه رنگ کمتر باشد، یعنی آنتیبادی در نمونه بیشتر است.
پ) وسترن بلات (Western Blotting - شکل ۲.۶) معمولاً به عنوان تست تأییدی (Confirmatory test) استفاده میشود (مثلاً برای تأیید FIV مثبت). در این روش، پروتئینهای عامل بیماری بر اساس وزن مولکولی با ژل الکتروفورز (SDS-PAGE) جدا شده و روی کاغذ نیتروسلولز منتقل میشوند. سپس با سرم حیوان واکنش داده و باندهای خاص تشکیل میشود.
ت) تست آگلوتیناسیون (Agglutination) آنتیبادیها (مخصوصاً IgM) میتوانند ذرات آنتیژنی (باکتری یا لاتکس) را به هم بچسبانند. - مثال: MAT برای تشخیص لپتوسپیروز (چسبیدن لپتوسپیراهای زنده) و تست لاتکس برای تشخیص آنتیژن کریپتوکوک. - هشدار مهم (پدیده پروزون - Prozone effect): اگر آنتیبادی بیش از حد باشد، همه ذرات را میپوشاند و از چسبیدن آنها جلوگیری میکند و باعث جواب منفی کاذب میشود. پس حتماً نمونه باید رقیق (Serial dilution) شود.
ث) انتشار ژل آگار (AGID - Agar Gel Immunodiffusion - شکل ۲.۷) آنتیژن و آنتیبادی در ژل پخش شده و در نقطه تعادل (Point of equivalence) خط رسوبی (Precipitin line) ایجاد میکنند. کاربرد اصلی: تشخیص آنتیبادی علیه قارچهایی مثل آسپرژیلوس، کوکسیدیوئیدس و بروسلا کنیس.
ج) خنثیسازی سرم (Serum Neutralization) برای ویروسها. سرم را با ویروس مخلوط کرده و به سلول اضافه میکنیم. هرچه تیتر آنتیبادی بالاتر باشد، ویروس بیشتر خنثی شده و سلول تخریب نمیشود (بدون CPE). کاربرد: دیستمپر و ویروسهای تنفسی.
پاسخ: جدول ۲.۱ (برای آنتیژن) و ۲.۲ (برای آنتیبادی) در کتاب بهخوبی این را پوشش دادهاند. اما مهمترین نکات کاربردی:
نقل قول از متن: “False-negative antibody test results can occur in severely immunosuppressed animals, such as in cats with advanced FIV infection that no longer can mount an immune response, or cats with advanced FIP (attributed to all patient antibody bound to viral particles and thus unable to bind to test substrate antigen).”
پاسخ: چون واکسنها باعث تولید آنتیبادی (مخصوصاً IgG) میشوند، یک تیتر مثبت IgG نمیتواند عفونت طبیعی را از واکسیناسیون قبلی تشخیص دهد. برای افتراق آنها: - در بیماری لایم (بورلیوز)، از تست وسترن بلات یا الایزاهای مخصوص که از پپتیدهای سنتتیک (مربوط به عفونت طبیعی) استفاده میکنند، میتوان برای افتراق واکسن از عفونت طبیعی کمک گرفت. - در بیماری FIV، واکسنهای موجود باعث مثبت شدن تستهای آنتیبادی معمولی میشوند و تشخیص را دشوار میکنند (البته اگر گربه هیچگاه واکسن FIV نخورده باشد، یک تست مثبت یعنی عفونت فعال مزمن).
| نوع تست | کاربرد اصلی | نکته طلایی برای تفسیر |
|---|---|---|
| تشخیص آنتیژن (مثل SNAP Heartworm/FeLV/Parvo) | نشان دادن حضور عامل بیماری | منفی => بیماری را رد نمیکند (بار کم یا کمپلکس). مثبت => حتماً با علائم بالینی و تست تأییدی بررسی شود. |
| تشخیص آنتیبادی (تیتر IgM) | عفونت حاد یا اخیر | مثبت IgM یعنی عفونت تازه شروع شده (طی ۱-۲ هفته). |
| تشخیص آنتیبادی (تیتر IgG) | عفونت مزمن یا پاسخ به واکسن | یک نمونه مثبت کافی نیست؛ برای تشخیص حاد، ۴ برابر افزایش در نمونه نقاهت لازم است. |
| تست تأییدی (مثل وسترن بلات) | تأیید موارد مثبت الایزا (مخصوصاً FIV) | استاندارد طلایی (Gold standard) در برخی بیماریها. |
اگر این مفاهیم را با شکلهای کتاب (شکل ۲.۱ برای زمانبندی پاسخ ایمنی، شکل ۲.۴ برای دستگاه SNAP، شکل ۲.۵ برای مکانیسم ساندویچ الایزا و شکل ۲.۷ برای AGID) مرور کنید، کاملاً مسلط خواهید شد.