قارچها از نظر ریختشناسی (مورفولوژی) به چند دسته تقسیم میشوند و اصطلاحات کلیدی آنها چیست؟
چرا تشخیص قارچها در آزمایشگاه خطرناک است و هماهنگی با آزمایشگاه چه اهمیتی دارد؟
نمونههای قارچی را چطور و با چه شرایطی باید جمعآوری و حمل کرد (مخصوصاً نمونههای پوستی، خون، ادرار و مایعات)؟
روشهای میکروسکوپی مستقیم (Direct Smear) برای دیدن قارچ در نمونه کدامند و هر کدام برای چه قارچی کاربرد دارد؟
رنگآمیزیهای بافتشناسی (هیستوپاتولوژی) برای تشخیص قارچ کدامند و مزایای هرکدام چیست؟
کشت قارچ (Fungal Culture) روی چه محیطهایی انجام میشود و هر محیط برای چه نوع قارچی انتخاب میشود؟
بعد از رشد قارچ در محیط کشت، چگونه آن را شناسایی (Identification) میکنیم؟
نتایج کشت چه زمانی مثبت کاذب یا منفی کاذب است؟
آزمایش تعیین حساسیت دارویی (Antifungal Susceptibility Testing) چگونه انجام میشود و محدودیتهای آن چیست؟
پاسخ به سوالات (با ترجمه روان و اصطلاحات انگلیسی)
❓ پرسش ۱: قارچها از نظر ریختشناسی به چند دسته تقسیم میشوند و اصطلاحات کلیدی آنها چیست؟
پاسخ: قارچها (Fungi) موجودات یوکاریوت (Eukaryotic) هستند. دو شکل پایهای (مورفولوژی) دارند:
کپک (Mold): به صورت رشتههای بلند به نام ریسه (Hyphae) وجود دارند. اگر ریسهها توسط دیواره عرضی به بخشهایی تقسیم شوند، Septate و اگر تقسیم نشوند، Nonseptate (یا Coenocytic) گویند. به توده این رشتهها، میسلیوم (Mycelium) میگویند.
مخمر (Yeast): تکسلولی هستند و با جوانهزدن (Budding) تکثیر میشوند. اگر جوانهها از هم جدا نشوند و زنجیرهای تشکیل دهند، به آن Pseudohyphae (ریسه کاذب) میگویند (به شکل ۴.۱ در کتاب مراجعه کنید که نمونه هیستوپاتولوژی کاندیدا را با رنگ H&E نشان میدهد).
💡 نکته طلایی برای آزمون: قارچهای دو ریختی (Dimorphic Fungi) در محیط (خاک) به صورت کپک و در بافت میزبان (حیوان) به صورت مخمر هستند. دما محرک این تغییر است.
استناد از متن اصلی:“Many pathogenic fungi exist as a mold in the environment, but convert to a yeast form in tissues. These fungi are called dimorphic fungi. Temperature can be a trigger for this conversion…”
واژهنامه تکمیلی:
هیفومیستها (Hyphomycetes): شامل دو زیرگروه هستند: الف) مونیلیاسیوس (Moniliaceous) که فاقد رنگدانه ملانین هستند (مثلاً آسپرژیلوس) و ب) دماتیاسیوس (Dematiaceous) که دارای رنگدانه ملانین هستند (مثلاً کلادوفیالوفورا).
آنامورف (Anamorph): مرحله غیرجنسی قارچ. تلهمورف (Teleomorph): مرحله جنسی قارچ. طبق اعلامیه آمستردام، امروزه تمایل به استفاده از یک نام برای هر قارچ داریم.
❓ پرسش ۲: چرا تشخیص قارچها در آزمایشگاه خطرناک است و هماهنگی با آزمایشگاه چه اهمیتی دارد؟
پاسخ: بسیاری از قارچهای بیماریزا (مانند کوکسیدیوئیدس، هیستوپلاسما و بلاستومایس) در محیط کشت آزمایشگاهی، اسپورهای هوابرد (Airborne Conidia) تولید میکنند که استنشاق آنها باعث عفونت شدید در پرسنل آزمایشگاه میشود. باید حتماً به آزمایشگاه اطلاع دهید که به قارچ خاصی مشکوک هستید تا محیط کشت مناسب و نکات ایمنی (بیولوژیک هود) رعایت شود.
استناد از متن اصلی:“Many pathogenic fungi are dangerous to culture because they produce airborne conidia (spores) that may lead to laboratory-acquired infections. The clinician should notify the diagnostic laboratory if a fungal infection is suspected.”
❓ پرسش ۳: نمونههای قارچی را چطور و با چه شرایطی باید جمعآوری کرد؟
پاسخ: اصول کلی شبیه کشت باکتری است، اما یخچال (Refrigeration) رشد برخی را مهار میکند و فریز (Freezing) اغلب مانع جداسازی قارچ میشود. جزئیات مربوط به هر نمونه:
نمونه پوست و مو (برای درماتوفیتها): محل ضایعه را با الکل ۷۰٪ بشویید (از ید استفاده نکنید چون قارچ را غیرفعال میکند). بهترین نمونه، کندن مو و پوسته از حاشیه ضایعه است. نمونه را در پاکت کاغذی تمیز (نه لوله پلاستیکی) به آزمایشگاه بفرستید، چون لوله رطوبت را نگه داشته و باعث رشد زیاد آلایندهها (Overgrowth of contaminants) میشود. در دمای اتاق نگهداری کنید.
استناد از متن اصلی:“The use of iodine should be avoided as it can inactivate dermatophytes… Envelopes are preferred to tubes because tubes retain moisture that can promote overgrowth of contaminants. Storage is best at room temperature because refrigeration can be harmful for some dermatophytes.”
خون (برای قارچهای سیستمیك): با بطریهای مخصوص Lysis-centrifugation (سیستم ایزولاتور) حساسیت جداسازی هیستوپلاسما، کوکسیدیوئیدس و کریپتوکوک را بالا میبرد. نمونه گیری از کاتتر وریدی توصیه نمیشود (چون ممکن است بیوفیلم قارچی داخل کاتتر را کشت دهیم).
ادرار: بهترین روش سیستوسنتز (Cystocentesis) است. نمونههای گرفته شده با کاتتر ادراری ممکن است کلونیزه شده باشند و تشخیص اشتباه دهند.
مایع مغزی-نخاعی (CSF) و مایعات: حداقل ۳ میلیلیتر CSF ایدهآل است. اگر بلافاصله کشت داده نشود، در دمای اتاق نگهداری شود (نمونههای استریل دیگر را میتوان شب تا صبح در یخچال گذاشت).
❓ پرسش ۴: روشهای میکروسکوپی مستقیم (Direct Smear) برای دیدن قارچ در نمونه کدامند؟
پاسخ: بررسی میکروسکوپی مستقیم قبل از کشت، امکان تشخیص اولیه (Presumptive Identification) را فراهم میکند.
آمادهسازی مرطوب (Wet Mount) با KOH (پتاسیم هیدروکسید): نمونه را در قطرهای از KOH ۱۰٪ روی لام قرار دهید. KOH باعث شفاف شدن کراتین و سلولها میشود ولی دیواره قارچ را سالم نگه میدارد. برای دیدن آرتروکنیدی (Arthroconidia) و هیف درماتوفیتها عالی است (به شکل ۴.۴ در کتاب، یعنی موهای آلوده به درماتوفیت را ببینید). برای شفافیت بهتر از DMSO (دیمتیل سولفوکسید) هم استفاده میشود.
جوهر هندی (India Ink) یا نیگروزین (Nigrosin): این رنگ، زمینه را تیره میکند و کپسول بزرگ کریپتوکوک (Cryptococcus) را به صورت هالهای روشن دور سلول مخمر نشان میدهد (به شکل ۴.۶ که کریپتوکوک در گرانولوم بینی گربه است، رجوع کنید). توجه: حساسیت این روش پایین است (کمتر از ۵۰٪ نمونههای مثبت CSF انسانی را تشخیص میدهد).
استناد از متن اصلی:“India ink… provides a dark background that outlines the large capsules surrounding the yeast cells… However, less than 50% of culture-positive human CSF samples are detected by this method, so it is relatively insensitive.”
کالکوفلور وایت (Calcofluor White): یک فلوروکروم است که به پلیساکاریدهای دیواره قارچ (کیتین و سلولز) متصل میشود. نیاز به میکروسکوپ فلورسانس با فیلتر ۳۶۵ نانومتر دارد. دیواره قارچ به رنگ سبز-آبی فلورسنت دیده میشود (شکل ۴.۵ آسپرژیلوس را ببینید).
❓ پرسش ۵: رنگآمیزیهای بافتشناسی برای تشخیص قارچ کدامند؟
پاسخ: بافتهای ثابت شده در فرمالین را میتوان با رنگهای مختلفی رنگ کرد:
H&E (هماتوکسیلین-ائوزین): رنگ روتین است و قارچهای سیستمیک (مانند کوکسیدیوئیدس، هیستوپلاسما) را نشان میدهد، اما برای هیفهای رشتهای ظریف، حساسیت کمی دارد.
PAS (اسید پریودیک-شیف): قارچ را به رنگ قرمز تیره (صورتی-مشکی) درمیآورد (شکل ۴.۸A).
GMS (نیترات نقره گوموری/متینامین نقره): دیواره قارچ را به رنگ قهوهای-مشکی با زمینه سبز کمرنگ نشان میدهد و حساسیت بالایی دارد (شکل ۴.۸B).
موسیکارمین (Mucicarmine): کپسول کریپتوکوک را به رنگ قرمز درمیآورد.
نکته جدول ۴.۲: رنگ گرم (Gram) برای مخمرها معمولاً مثبت و برای کپکها منفی یا رنگنپذیرفته است. رنگهای رومانوفسکی (رایت، گیمسا، دیف-کوییک) برای هیستوپلاسما بهترین انتخاب هستند.
❓ پرسش ۶: کشت قارچ روی چه محیطهایی انجام میشود؟
پاسخ: هیچ محیط کشت واحدی برای همه قارچها بهینه نیست (جدول ۴.۳ را ببینید):
سابورو دکستروز آگار (SDA - Sabouraud Dextrose Agar): محیط پایه و عمومی با pH پایین.
DTM (Dermatophyte Test Medium): مخصوص درماتوفیتها. حاوی آنتیبیوتیک (جنتامایسین/کلرامفنیکل)، سیکلوهگزامید (Cycloheximide) (برای مهار کپکهای ساپروفیت آلودهکننده) و فنلرد (نشانگر رنگ) است. رشد درماتوفیت باعث قلیایی شدن و تغییر رنگ محیط به قرمز میشود. توجه: برخی ساپروفیتها هم محیط را قرمز میکنند و برخی درماتوفیتها نیز ممکن است دیر تغییر رنگ دهند.
دمای انکوباسیون: کمتر از باکتری (حدود ۲۵ تا ۳۰ درجه سانتیگراد). پلیتها را حداقل به مدت ۴ هفته قبل از منفی اعلام کردن، چک کنید.
استناد از متن اصلی:“All plates should be sealed with oxygen-permeable shrink seal or tape to prevent exposure of laboratory personnel to potentially dangerous conidia…”
❓ پرسش ۷: بعد از رشد، چگونه قارچ را شناسایی میکنیم؟
پاسخ: شناسایی بر اساس موارد زیر انجام میشود:
شکل کلنی (Colony Morphology): مخمرها معمولاً مرطوب، موکوئیدی (لزج) یا مومی هستند (شکل ۴.۹A که کریپتوکوک گاتی را نشان میدهد). کپکها خشک، پودری یا پنبهای هستند. کلنی دماتیاسیوس (رنگدانهدار) تیره است (شکل ۴.۹B برای کلادوفیالوفورا).
میکروسکوپی (با نوار چسب و لاکتوفنول آنیلین بلو - LPAB): به شما امکان میدهد که آرایش کنیدیها، ماکروکنیدی و میکروکنیدی را ببینید. شکل ۴.۱۳ (میکروسپوروم کانیس با ماکروکنیدی دوکمانند) و شکل ۴.۱۴ (تریکوفایتون منتاگروفایتیس با میکروکنیدی کروی) را ببینید.
تست ژرم تیوب (Germ Tube Test): برای افتراق کاندیدا آلبیکنس از سایر کاندیداها. اگر کلنی کاندیدا را در سرم در ۳۵ درجه به مدت ۲-۳ ساعت قرار دهید، تشکیل لولههای جوانهای (ژرم تیوب) میدهد (شکل ۴.۱۵).
MALDI-TOF MS: جدیدترین تکنولوژی که طیف پروتئینی قارچ را با بانک اطلاعاتی مقایسه و در عرض چند دقیقه شناسایی میکند. برای مخمرها مستقیم و برای کپکها نیاز به عصارهگیری (Extraction) دارد.
مولکولی (PCR و Sequencing): معمولاً از ناحیه Internal Transcribed Spacer (ITS) یا D2 منطقه ژن rRNA بزرگ (LSU) برای تعیین توالی و شناسایی دقیق استفاده میشود.
❓ پرسش ۸: نتایج کشت چه زمانی مثبت کاذب یا منفی کاذب است؟
پاسخ:
منفی کاذب (False-Negative): حجم نمونه کم باشد، تعداد ارگانیسم کم باشد، باکتریهای همراه رشد کنند، یا حیوان تحت درمان با داروی ضدقارچ باشد. همچنین اگر نمونه به مدت طولانی حمل شود و زندهمانی قارچ از بین برود.
استناد از متن اصلی:“Negative test results can occur for many reasons, including, but not limited to, inadequate specimen size… overgrowth with contaminating bacteria… loss of organism viability during specimen transportation.”
مثبت کاذب (False-Positive): شایعترین علت، آلودگی با قارچهای ساپروفیت (Saprophytic Fungi) محیطی مانند آسپرژیلوس یا پنیسیلیوم است. برای تشخیص قطعی، حتماً باید وجود قارچ همراه با التهاب در نمونه مستقیم (سیتولوژی) دیده شود.
استناد از متن اصلی:“Contamination by saprophytic fungi, especially Aspergillus or Penicillium spp., is the most common cause of false-positive fungal cultures.”
پاسخ: با افزایش مقاومت دارویی، تقاضا برای این تست بالا رفته است. روش اصلی، براث میکرودایلوشن (Broth Microdilution) است که میزان MIC (حداقل غلظت مهارکنندگی) را اندازهگیری میکند (شکل ۴.۱۶ را ببینید).
مشکلات و محدودیتها (بسیار مهم برای آزمون):
عدم وجود Breakpoint دامپزشکی: هنوز نقاط برش اختصاصی برای حیوانات تعیین نشده و گزارش بر اساس استانداردهای انسانی صادر میشود. در گزارش، معمولاً فقط عدد MIC درج میشود، نه اینکه بگویند حساس یا مقاوم است.
پدیده تریلینگ (Trailing): در برخی قارچها، رشد در محدوده غلظتهای بالای دارو به طور کامل متوقف نمیشود و رشد نسبی (Partial Inhibition) دیده میشود که خواندن MIC را سخت میکند.
رشد کند: کشت و تست قارچها زمانبرتر از باکتریهاست.
استناد از متن اصلی:“Although veterinary breakpoints are still lacking, antifungal susceptibility testing allows comparison of the activity of two or more antifungal drugs… The report to the clinician would not/should not provide interpretations but would provide MIC values…”
داروهای متداول تست شده شامل: آمفوتریسین B، فلوکونازول، ایتراکونازول، وریکونازول، پوزاکونازول، کاسپوفونگین و فلوستوزین هستند.
🎯 جمعبندی برای شب امتحان (راهنمای سریع رنگها و محیطها):
برای دیدن دیواره قارچ در بافت → GMS (مشکی) یا PAS (صورتی/قرمز).
برای دیدن کپسول کریپتوکوک → جوهر هندی (هاله شفاف) یا موسیکارمین (قرمز).
برای تشخیص هیستوپلاسما در سیتولوژی → رایت/گیمسا.
برای کشت درماتوفیت → DTM (تغییر رنگ به قرمز).
برای کشت عمومی قارچها → SDA (اسیدی، دمای ۲۵-۳۰ درجه، ۴ هفته).